最终诊断

包括我们的样本(补充图2G和H)，TCGA（补充图2I和J），AE-Meta(补充图2K和L)和K-MPlotter(补充图2M?O)，在相同临床阶段的NSCLC患者中也有类似的发现。

?综上所述，我们的研究结果表明，低表达HLF与NSCLC患者的早期进展和晚期临床病理特征显著正相关。

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?进一步研究发现，在NSCLC患者中，HLF下调与较短的局部无复发生存期和远处无转移生存期呈正相关(补充图3A-D)。同样，低表达HLF的ADC患者以及SQC患者(补充图3I-L)的局部无复发生存期和远处无转移生存期较差(补充图3E-H)。以上结果说明，低表达HLF促进NSCLC早期局部复发和多器官远处转移。

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?为了进一步确定HLF在NSCLC细胞局部肺定植和远处转移中的作用，首先在多个不同亚型的NSCLC细胞株中检测了HLF的表达。

?如补充图4A和B所示，与非癌永生化肺支气管上皮细胞BEAS-2B和正常肺成纤维细胞WI-38相比，NSCLC细胞中HLF的mRNA和蛋白质水平差异下调。我们进一步构建了HLF过表达的NCI-H1975(H1975)和NCI-H520(H520)肺癌细胞，这些细胞表达所有NSCLC细胞系中HLF水平最低，并内源性下调NCI-H460(H460)和NCI-H1299(H1299)细胞HLF的表达，这两种细胞均表达最高的内源性HLF水平(补充图4C和D）。

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?采用小鼠尾静脉模型研究NSCLC细胞的肺定植和生长能力。如图3A-D和补充图4E，上调HLF显著抑制H1975细胞在肺中的肿瘤发生，表现为肺结节的形成减少，每m㎡的癌细胞数量减少，累积生存率延长。相反，沉默HLF对H460细胞有相反的效果(图3A-C、E和补充图4E)。

?值得注意的是，HLF表达的改变不仅影响大肺结节的形成(在分析的肿瘤切片中定义为>50肿瘤细胞)(图3B)，但也影响小肺结节的形成(在分析的肿瘤切片中定义为5-50个肿瘤细胞)(补充图4E)，这支持了HLF在肿瘤细胞的早期定植和随后的肺内生长中都起着重要作用的观点。谷

?最后，与实验结束时相比，在注射HLF稳定过表达的H1975细胞和下调H460细胞的小鼠肿瘤组织中，进一步证实了相应的高和低表达水平(补充图4F)。

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?然后，采用体内左心室接种小鼠模型检测HLF对NSCLC远处转移能力的影响，将载体/NCI-H1975、HLF过表达NCI-H1975、载体/NCI-H460和HLFsh#1/NCI-H460细胞接种到小鼠左心室。

?接种细胞6周后，收集小鼠的胫骨、脑、肝组织，并进行H&E染色处理。如图所示。图3F-I和补充图4G，我们在与载体组相比，过HLF表达小鼠组中，包括骨、大脑和肝脏等远处器官检测到较少的转移性肿瘤，以及较长的累积存活期延长。

?相比之下，沉默HLF可显著增强骨、脑和肝脏转移瘤的形成，并缩短生存期(图3F-I和补充图4H)。

?因此，这些结果表明，低表达HLF的NSCLC细胞具有更强的局部定植和生长能力，以及更强的远处转移能力。

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?我们利用CCK-8、集落形成和An连接素凋亡进一步研究了HLF在NSCLC中的生物学功能，发现在正常培养条件下，HLF对NSCLC细胞的增殖和凋亡能力没有显著影响(补充图5A–C)。

?我们的结果显示，上调HLF会增加培养液的PH水平，而沉

默HLF会降低培养基的pH水平，但正常情况下HLF并不影响NSCLC细胞的表型和数量(补充图5D)。

?低表达HLF可能通过营养代谢途径促进NSCLC细胞对低营养状态的适应，因为即使在正常的含氧条件下，癌细胞也更倾向于通过厌氧途径代谢。

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?然而，上调HLF抑制NSCLC的生长，而沉默HLF可促进NSCLC细胞的锚定和悬浮生长能力(图4A和B)，表明沉默HLF增强了NSCLC细胞在悬浮条件下的生存能力，即anoikis耐药。这是各种癌症中与远处转移有关的转移性癌细胞的主要特征。

?事实上，昼夜节律基因的失调导致了NSCLC的代谢失调，HLF广泛参与了多种物质代谢过程，包括脂质和氧化代谢。

?在低血清(1%)和低葡萄糖(1g/L)培养液组成的低营养条件下，HLF过表达抑制了

NSCLC细胞的增殖，但增加了凋亡潜能，反之亦然（图4C-E）。

?HLF参与了癌细胞生长培养基的营养代谢，这是HLF抑制NSCLC细胞生长的前提条件。